抗菌肽是一類具有顯著抑菌活性的多肽類物質(zhì)，具有穩(wěn)定性好、不易產(chǎn)生耐藥性和生物安全性高等優(yōu)勢，是傳統(tǒng)抗生素的潛在替代品。目前，抗菌肽主要有生物提取法、化學(xué)合成法和基因工程表達(dá)法等 3 種制備途徑。其中抗菌肽微生物異源表達(dá)法屬基因工程表達(dá)法的一種，作為一種新型制備方法，具有更高的經(jīng)濟(jì)性、便捷性和高效性，是抗菌肽規(guī)?；a(chǎn)重要策略和制備手段。當(dāng)前，抗菌肽微生物異源表達(dá)系統(tǒng)主要包括原核生物、真核生物和桿狀病毒等3類表達(dá)系統(tǒng)。原核生物表達(dá)系統(tǒng)主要包括大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)、枯草芽孢桿菌表達(dá)系統(tǒng)和乳酸桿菌系統(tǒng)，真核表達(dá)系統(tǒng)主要包括酵母表達(dá)系統(tǒng)和微藻表達(dá)系統(tǒng)，而病毒表達(dá)系統(tǒng)主要是桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)?？咕漠愒幢磉_(dá)以原核與真核異源表達(dá)系統(tǒng)為主要表達(dá)體系，其中，細(xì)菌與酵母是抗菌肽最主要宿主，占抗菌肽異源表達(dá)系統(tǒng)的97.4%。

原核生物表達(dá)系統(tǒng)

1、大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)

大腸桿菌（Escherichia coli，E.coli）表達(dá)系統(tǒng)是抗菌肽首選異源表達(dá)系統(tǒng)，具有遺傳背景清晰、表達(dá)水平高、培養(yǎng)成本低和操作簡單等優(yōu)勢，但存在翻譯后修飾不足，易產(chǎn)生包涵體和受內(nèi)毒素污染等不足，常采取融合蛋白標(biāo)簽方式表達(dá)，常用載體有pGEX、pRSET和pET等，特別是pET。有研究利用大腸埃希菌系統(tǒng)成功表達(dá)并純化了來自青葙(Celosia argentea L.)中的抗菌肽Aq，表達(dá)產(chǎn)量可高達(dá)38 mg/L?？咕姆肿恿啃　⒁妆坏鞍酌杆?，因此，可將抗菌肽與一個蛋白質(zhì)連接進(jìn)行融合表達(dá)，然后通過試劑或酶處理除去連接蛋白，獲得純抗菌肽。如在大腸埃希菌BL21(DE3)中建立SUMO融合表達(dá)系統(tǒng)，經(jīng)TEV蛋白酶高效切割后，重組新型雜合肽CLP的產(chǎn)率為27.56 mg/L，純度93.6%，對銅綠假單胞菌337005的MIC為2 μg/mL，對金黃色葡萄球菌1882的MIC為8 μg/mL，對產(chǎn)腸毒素大腸埃希菌K88的MIC為2 μg/mL。雖然大腸埃希菌已被廣泛用作異源蛋白質(zhì)表達(dá)的宿主，但仍存在某些限制，如容易產(chǎn)生內(nèi)毒素，不能用于修飾蛋白表達(dá)等。

2、乳酸桿菌表達(dá)系統(tǒng)

乳酸桿菌（Lactobacillus）是一種新興的異源表達(dá)系統(tǒng)，對乙醇、鹽、低pH和寬溫度范圍具有較好耐受性，不產(chǎn)生內(nèi)毒素，生物安全性高，不分泌本源蛋白，只產(chǎn)生一種分泌蛋白和一種膜結(jié)合胞外蛋白酶，且易被敲除，純化操作簡單，可降低重組蛋白被內(nèi)源蛋白降解風(fēng)險，還能定植腸道并與腸粘膜屏障結(jié)合，是重組蛋白異源表達(dá)的理想載體。例如，將PR39基因片段插入干酪乳酸桿菌(Lactobacillus casei)分泌表達(dá)載體pPG：612，成功實(shí)現(xiàn)了豬抗菌肽PR39在重組干酪乳酸桿菌中的表達(dá)，體外抗菌試驗(yàn)表明，PR39肽在重組菌中的表達(dá)對大腸埃希菌和沙門菌(Salmonella)均有抗菌作用；片球菌素(pediocin)PA-1是一種廣譜乳酸菌細(xì)菌素，有研究選擇植物乳桿菌(Plant lactobacillus)LB-B1作為宿主，表達(dá)片球菌素PA-1的先導(dǎo)肽小菌素(microcin V)，經(jīng)Tricine-SDS-PAGE凝膠實(shí)驗(yàn)，microcin V在植物乳桿菌LB-B1中可以成功表達(dá)和分泌。乳酸桿菌作為一種益生菌，菌體本身對機(jī)體有益生作用，其分泌的多種物質(zhì)是機(jī)體必不可少的且不產(chǎn)生內(nèi)毒素，有作為動物飼料添加劑的潛力。將環(huán)狀細(xì)菌素plantacyclin B21AG基因族克隆至pCycB21質(zhì)粒載體并在L. plantarum WCFS1中能成功異源表達(dá)；將富含脯氨酸的抗菌肽PR39合成片段插入分泌表達(dá)載體質(zhì)粒pPG:612中，在重組菌株L.casei 393異源成功表達(dá)，該重組表達(dá)系統(tǒng)具有干酪乳桿菌和PR39有益特性；有研究根據(jù)密碼子偏好性合成抗菌肽Plf成熟肽編碼序列，將其連接到表達(dá)載體pPG612.1的Xho I/BamH I位點(diǎn)，通過電穿孔分別轉(zhuǎn)入L. casei ATCC393、L.pentosus KLDS1.0413、L.plantarum KLDS1.0344和L. paracasei KLDS1.0652，木糖誘導(dǎo)后，表達(dá)量分別為9.6 μg/mL、10.8 μg/mL，12.5 μg/mL和9.9 μg/mL；還有研究將氯離子誘導(dǎo)型啟動子（CIP）和基于密碼子偏好性優(yōu)化的Stomoxyn基因克隆至載體pUC57中，將啟動子和抗菌肽基因插入pNZ8048質(zhì)粒中，重組蛋白達(dá)最高水平（24 μg/L）。

3、枯草芽孢桿菌表達(dá)系統(tǒng)

枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)是動物飼料中常添加的益生菌種，同時作為基因工程菌也為抗菌肽的生產(chǎn)提供了一條良好的途徑。有研究以枯草芽孢桿菌WB800N為宿主菌株，6％麥芽糖誘導(dǎo)重組融合肽cecropin AD(CAD)在培養(yǎng)基中成功表達(dá)并檢測到表達(dá)產(chǎn)物，重組CAD表現(xiàn)出與合成CAD相似的抗菌活性；PR-FO是抗菌肽PRW4與fowlicidin-2雜合得到的一種新型α螺旋抗菌肽，將其在枯草芽孢桿菌WB800N中表達(dá)，可獲得純度為90%的重組PR-FO，對革蘭陰性菌(MIC為1~4.48 μg/mL)和革蘭陽性菌(MIC為4~12.56 μg/mL)均表現(xiàn)出高抑制活性，且重組PR-FO在最大濃度128 μmol/L下溶血率僅為10%；有研究構(gòu)建了兩個攜帶成熟PapA肽密碼子序列的載體，一個有His標(biāo)簽，另一個沒有His標(biāo)簽，將兩個質(zhì)粒轉(zhuǎn)入枯草芽孢桿菌WB800N，經(jīng)誘導(dǎo)，菌株成功分泌融合蛋白PapA1和PapA2，且均具有活性，說明標(biāo)簽不會影響枯草芽孢桿菌表達(dá)異源蛋白?？莶菅挎邨U菌表達(dá)系統(tǒng)已被廣泛應(yīng)用于各種化學(xué)品、醫(yī)藥產(chǎn)品、食品和酶的生產(chǎn)。然而，由于缺乏對代謝途徑和表達(dá)元件的了解，在該表達(dá)系統(tǒng)中優(yōu)化異源蛋白的產(chǎn)生還存在各種障礙。

真核生物表達(dá)系統(tǒng)

1、酵母表達(dá)系統(tǒng)

常用的酵母表達(dá)系統(tǒng)有釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)和畢赤酵母(Pichia pastoris)。釀酒酵母不產(chǎn)生毒素，被廣泛應(yīng)用于食品生產(chǎn)、藥物蛋白生產(chǎn)等。與原核生物表達(dá)系統(tǒng)相比，釀酒酵母具有較為完整的翻譯后修飾和分泌能力，在異源表達(dá)目的蛋白時表現(xiàn)出極大的優(yōu)勢。為了研究人α-防御素5(human α-defensin5，HD5)在釀酒酵母中分泌表達(dá)的可行性，有研究將重組載體pVT102U/α-HD5轉(zhuǎn)入釀酒酵母S78中，結(jié)果顯示，重組菌發(fā)酵上清液中檢測出表達(dá)產(chǎn)物HD5，且HD5對金黃色葡萄球菌的MIC為10 mg/mL，對大腸埃希菌和沙門桿菌的MIC為40 mg/mL；還有學(xué)者將抗菌肽cecropin XJ基因克隆到Pyes2/Ct/α表達(dá)載體，并在釀酒酵母INVSc1中誘導(dǎo)重組蛋白表達(dá)120 h后，重組cecropin XJ最大分泌量為1141 mg/L，且分泌產(chǎn)物活性高，對大腸埃希菌ATCC 25922的MIC為0.81 μmol/L。

與釀酒酵母相比，畢赤酵母系統(tǒng)在分泌蛋白的糖基化方面具有優(yōu)勢，同時有很多高水平的組成型啟動子，可使其表達(dá)水平比釀酒酵母高數(shù)倍。將人α-防御素5在釀酒酵母中表達(dá)，總表達(dá)量為69.62 mg/L，而將其在畢赤酵母中表達(dá)，可成功獲得表達(dá)量約120 mg/L的發(fā)酵上清；還有研究利用釀酒酵母和畢赤酵母分別表達(dá)了抗菌肽enterocin L50A和L50B，畢赤酵母表達(dá)的兩種抗菌肽活力分別是釀酒酵母的6~60倍。研究表明，與大腸埃希菌相比，畢赤酵母表達(dá)出的抗菌肽也往往顯示出更高的抗菌活性。Hispidalin是從冬瓜種子中分離出的一種新型抗菌肽，其首次在大腸埃希菌和畢赤酵母中成功表達(dá)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)大腸埃希菌來源的重組hispidalin對所有供試菌株均無抗菌活性，而畢赤酵母來源的重組hispidalin(r hispidalin)對5種革蘭陰性和陽性致病菌均表現(xiàn)出廣譜抗菌活性，可以有效透化細(xì)胞質(zhì)膜并破壞靶向細(xì)菌細(xì)胞的形態(tài)。此外，r hispidalin顯示出廣泛的熱穩(wěn)定性和pH穩(wěn)定性，以及小于2%的溶血活性。

2、微藻表達(dá)系統(tǒng)

微藻表達(dá)系統(tǒng)具有少污染、可再生、大生物量等特性，是繼大腸埃希菌和酵母表達(dá)系統(tǒng)之后較有發(fā)展前景的表達(dá)系統(tǒng)。為了解抗菌肽在微藻中的表達(dá)，有研究將抗菌肽Cath-1a表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化三角褐指藻(Phaeodactylum tricornutum)并成功表達(dá)外源抗菌肽，且轉(zhuǎn)化子對遲緩愛德華菌(Edwardsiella tarda)有明顯抑菌效果；有學(xué)者以萊茵衣藻(Chlamydomonas reinhardtii)作為細(xì)胞工廠，重組表達(dá)雜合抗菌肽mytichitin-CB-hispidalin，經(jīng)MIC和抑菌圈實(shí)驗(yàn)顯示其對大腸埃希菌ATCC 10305和腸炎沙門菌(Salmonella enteritidis)ATCC 10467均具有抑菌效果，MIC均為20 μg/mL。微藻生長速度快、蛋白質(zhì)含量高、氨基酸組成合理，有望成為異源表達(dá)系統(tǒng)的有效替代品。不過，目前尚未出現(xiàn)一個穩(wěn)定的微藻表達(dá)系統(tǒng)。

3、桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)

桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)（baculovirus expression system，BEVS）是一種新型外源蛋白表達(dá)系統(tǒng)，具有操作簡單、容納外源基因大、表達(dá)后修飾和安全性高、成本低等優(yōu)勢，已經(jīng)在疫苗生產(chǎn)、基因治療和組織工程等領(lǐng)域得到了應(yīng)用，但也存在一些不足，如桿狀病毒-昆蟲細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)是一個瞬時表達(dá)系統(tǒng)，且桿狀病毒表達(dá)載體啟動子為晚期啟動子，重組蛋白高水平表達(dá)時間短，末端缺乏復(fù)雜糖基化修飾，翻譯后修飾速度與表達(dá)速度不匹配等。有研究使用AnpeNPV桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)異源表達(dá)抗菌肽Anpe-MLP1，并對其進(jìn)行純化和鑒定，結(jié)果顯示抗菌肽表達(dá)成功，重組Anpe-MLP1對溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)、河流弧菌(Vibrio fluvialis)和副溶血性弧菌(Vibrio parahaemolyticus)的MIC均為5.4 μg/mL；具有強(qiáng)抗細(xì)菌活性的重組蛋白有時很難用細(xì)菌表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)，還有學(xué)者利用家蠶-桿狀病毒蛋白表達(dá)系統(tǒng)成功制備了人β-防御素(DEFB 1、DEFB 2和DEFB 3)。結(jié)果表明，重組的DEFB 2對大腸埃希菌、銅綠假單胞菌、硫桿菌(Thiobacillus)均有抗菌活性。

總之，不同表達(dá)系統(tǒng)均有其優(yōu)缺點(diǎn)，在具體選擇用于生產(chǎn)抗菌肽的宿主系統(tǒng)時，應(yīng)根據(jù)抗菌肽的分子量大小、細(xì)胞內(nèi)定位和分泌情況等確定。如選擇大腸埃希菌作為宿主，生長速度快但翻譯能力弱，使得表達(dá)的抗菌肽穩(wěn)定性較差，而酵母表達(dá)系統(tǒng)對蛋白質(zhì)的正確加工和翻譯后修飾都要強(qiáng)于大腸埃希菌；當(dāng)抗菌肽分子量小，選擇酵母表達(dá)系統(tǒng)則容易被內(nèi)源性蛋白酶降解，而乳酸桿菌幾乎不分泌本源蛋白，能間接降低抗菌肽被內(nèi)部分解的風(fēng)險。所以選擇合適的表達(dá)宿主，對于高效表達(dá)抗菌肽至關(guān)重要。此外，有時直接表達(dá)抗菌肽，表達(dá)產(chǎn)物可能對宿主有害，進(jìn)而影響蛋白質(zhì)的高水平表達(dá)，此時可應(yīng)用融合蛋白等策略對表達(dá)系統(tǒng)進(jìn)行優(yōu)化，適當(dāng)克服此問題。

參考資料

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[2] 肖懷秋,李玉珍,林親錄,等.抗菌肽結(jié)構(gòu)優(yōu)化與改造策略研究進(jìn)展[J].中國釀造,2021,40(10):12-18.

作者簡介：

小米蟲，藥品質(zhì)量研究工作者，長期致力于藥品質(zhì)量研究及藥品分析方法驗(yàn)證工作，現(xiàn)就職于國內(nèi)某大型藥物研發(fā)公司，從事藥品檢驗(yàn)分析及分析方法驗(yàn)證。