在自然界中，組成生物體的蛋白質(zhì)都是由20種氨基酸排列組合而來。氨基酸序列包含了它能形成蛋白質(zhì)的所有結(jié)構(gòu)信息，經(jīng)過空間折疊后形成特定的三維構(gòu)象，在細胞內(nèi)發(fā)揮特定的功能——有的與受體結(jié)合，激活特定的信號通路；有的結(jié)合DNA，控制基因的開關(guān)；有的識別病原體，啟動免疫反應(yīng)。
因此，如果能準(zhǔn)確模擬出蛋白質(zhì)折疊后的三維構(gòu)象，就能改造蛋白甚至從頭設(shè)計出全新蛋白。然而，天然的生物蛋白都是經(jīng)過漫長的進化過程才逐漸演化而來，想要無中生有般從頭設(shè)計出一種全新且有功能的蛋白質(zhì)十分困難。
近年來，以 David Baker 被代表的科學(xué)家在蛋白質(zhì)設(shè)計領(lǐng)域取得了一系列突破，并因此獲得了2024年諾貝爾化學(xué)獎。
2024年12月5日，David Baker 教授團隊在國際頂尖學(xué)術(shù)期刊 Science 上發(fā)表了題為：Target-conditioned diffusion generates potent TNFR superfamily antagonists and agonists 的研究論文。
研究團隊使用他們之前開發(fā)的RFdiffusion算法來設(shè)計腫瘤壞死因子受體（TNFR）的結(jié)合蛋白。研究團隊在初始設(shè)計生成后使用部分擴散設(shè)計出具有低皮摩爾級親和力的結(jié)合蛋白，同時還具有高特異性的優(yōu)點。這些人工設(shè)計的蛋白質(zhì)可以應(yīng)用于生物學(xué)研究，并可能作為潛在的疾病治療藥物。
研究團隊表示，為重要的藥理學(xué)靶點設(shè)計高親和力和高特異性的拮抗劑和激動劑的能力，預(yù)示著蛋白質(zhì)設(shè)計時代正在到來，在這個時代，蛋白質(zhì)結(jié)合劑是通過計算而不是通過免疫或隨機篩選方法產(chǎn)生的。
如何設(shè)計出具有高親和力和特異性結(jié)合目標(biāo)蛋白的人工蛋白，是計算結(jié)構(gòu)生物學(xué)在治療、診斷等領(lǐng)域的長期挑戰(zhàn)。為了解決這一問題，蛋白質(zhì)設(shè)計需要依賴于預(yù)先存在的支架組——要么是天然蛋白質(zhì)，要么是從頭設(shè)計，它們通常具有明確的三級結(jié)構(gòu)。
2023年7月11日，David Baker 教授團隊在 Nature 期刊發(fā)表了題為：De novo design of protein structure and function with RFdiffusion 的研究論文【2】，開發(fā)并描述了一種能從頭設(shè)計生成全新蛋白質(zhì)的人工智能算法——RoseTTAFold Diffusion，簡稱RFdiffusion。該方法能生成各種功能性蛋白質(zhì)，包括在天然蛋白質(zhì)中從未見過的拓撲結(jié)構(gòu)。
RFdiffusion通過對氨基酸殘基的隨機空間分布進行逐步去噪來生成新的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)。這一擴散去噪過程可以通過條件信息進行引導(dǎo)，從而創(chuàng)造出多種多樣的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和功能。例如，在設(shè)計結(jié)合蛋白時，擴散軌跡是在固定目標(biāo)物存在的情況下進行的。
事實上，David Baker 團隊已經(jīng)使用RFdiffusion生成基于相似理想支架的結(jié)合蛋白，同時也測試了無約束擴散，但僅產(chǎn)生了簡單的三螺旋或四螺旋束。使用具有規(guī)則二級結(jié)構(gòu)元素和堆積的小型理想支架的優(yōu)勢在于，經(jīng)過序列設(shè)計后，相當(dāng)一部分設(shè)計有可能按預(yù)期折疊。然而，這種方法限制了形狀匹配的程度，特別是對于那些表面相對平坦且缺乏凹陷以供小型迷你蛋白適應(yīng)的靶標(biāo)。實際上，目前為止，自主設(shè)計的結(jié)合蛋白的接觸分子表面（CMS）低于許多天然蛋白復(fù)合物。
在這項最新研究中，David Baker 團隊推測，通過使用RFdiffusion直接從完全隨機的氨基酸殘基分布生成較大蛋白質(zhì)，可以克服依賴支架或短鏈方法所能實現(xiàn)的有限形狀匹配，而無需依賴于現(xiàn)有支架的指導(dǎo)。
研究團隊聚焦于腫瘤壞死因子受體超家族（TNFRSF），該家族包含許多重要的藥物靶點，例如在炎癥性疾病中發(fā)揮關(guān)鍵作用的腫瘤壞死因子受體1（TNFR1）。通過應(yīng)用RFdiffusion，研究團隊生成了96個可能與TNFR1結(jié)合的人工設(shè)計蛋白，而表面等離子體共振（SPR）實驗表明，有6個人工設(shè)計蛋白可與TNFR1結(jié)合，其中TNFR1_mb1和TNFR1_mb2具有與TNFR1結(jié)合的高親和力，并同時具有高度特異性——只與TNFR1結(jié)合，而不與TNFR2結(jié)合。
形狀互補結(jié)合蛋白的擴散研究
為了進一步優(yōu)化TNFR1_mb2和TNFR1_mb1的親和力，David Baker 團隊采用了部分擴散的方法：對骨架部分進行噪聲化處理（超過15-25步；50步產(chǎn)生完全隨機分布），然后使用RFdiffusion去噪，這產(chǎn)生了與原始設(shè)計相似但不同的新骨架。
令人驚訝的是，部分擴散優(yōu)化處理產(chǎn)生的TNFR1_mb2_pd1與TNFR1的結(jié)合親和力增加了三個數(shù)量級，達到低于10 pM。這種低皮摩爾級的親和力遠高于任何此前報道的單體TNFR1結(jié)合蛋白。例如，腫瘤壞死因子（TNF-α）作為天然存在的TNFR1結(jié)合蛋白，其與TNFR1的結(jié)合親和力也僅為19 pM。
研究團隊表示，在優(yōu)化后的TNFR1_mb2_pd1中，部分擴散所帶來的親和力的顯著增加可能是由于額外的界面以及與結(jié)合裂縫之間更好的整體擬合，這導(dǎo)致了多個附加接觸點的形成。
部分擴散產(chǎn)生具有低皮摩爾級親和力的結(jié)合蛋白
鑒于部分擴散在增加結(jié)合親和力方面的成功，研究團隊進一步測試了該方法是否可以應(yīng)用于其他TNFR家族成員，這些成員在序列上是不同的，但具有非常相似的三維結(jié)構(gòu)。結(jié)果顯示，這種設(shè)計方法可以很好地應(yīng)用到其他TNFR家族成員的人工結(jié)合蛋白的設(shè)計、篩選和優(yōu)化中。
部分擴散產(chǎn)生高特異性的TNFR2結(jié)合蛋白
不僅如此，為了實現(xiàn)更廣闊的應(yīng)用，David Baker 團隊還證明了TNFR1_mb2_pd1可以作為拮抗TNF-α信號傳導(dǎo)的人工抑制劑，表明它可能是阻斷炎癥的候選藥物。此外，他們還針對4-1BB和OX40設(shè)計了超激動劑，這些高親和力單體結(jié)合劑能夠構(gòu)建多種可溶性信號分子，提供比當(dāng)前基于天然配體加交聯(lián)抗體的方法更多的控制。
可溶性低聚物4-1BB和OX40超激動劑的設(shè)計
總的來說，這項發(fā)表于 Science 的研究提出了一種基于計算結(jié)構(gòu)生物學(xué)設(shè)計和開發(fā)人工結(jié)合蛋白的新方法。這一研究為藥理學(xué)上的關(guān)鍵靶點設(shè)計高親和力和高特異性拮抗劑和激動劑提供了新的方向，為蛋白質(zhì)設(shè)計領(lǐng)域的一個即將到來的新時代揭開帷幕。
論文鏈接：
1. https://www.science.org/doi/10.1126/science.adp1779
2. https://www.nature.com/articles/s41586-023-06415-8
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